人参皂苷是一系列糖基化三萜类化合物，由一个疏水苷元部分与一至四个亲水糖苷部分融合而成，具有多种生物学特性。人参皂苷 Compound K( CK) 属于原人参二醇类人参皂苷，构型为四环三萜达玛烷型人参皂苷，是口服人参或人参皂苷后在哺乳动物血液和器官中检测到的重要成分之一[4,5]，具有抗过敏[6]、抗糖尿病[7]、抗癌作用[8,9]、抗炎药[10,11]、抗衰老[12]、保肝效果[13]等。

但人参皂苷CK 在天然中几乎不存在，无法满足现今开发应用的需求，其主要是通过化学合成、酶转化和微生物转化来进行生产[14]。本文对近年来人参皂苷CK生物转化合成的研究方法进行了综述，对不同的转化合成方法进行比较分析，总结转化过程条件与结构变化规律，为人参皂苷CK的生物转化合成提供参考。

图1人参皂苷CK的化学结构

1 人参皂苷CK结构特性

人参皂苷CK属于四环达玛烷型三萜类皂苷，在自然界中几乎不存在，据早期文献记载，它是1972年由Kitagawa从人参皂苷Rb1、Rb2和Rc的水解酶混合物中首次发现的^[16]。此后，研究人员系统阐述了肠道细菌如何将进行生物转化合成稀有人参皂苷CK，Hasegawa等人通过发现肠道细菌可以将CK转化成为人参皂苷的特定代谢途径，提出人参皂苷是肠道细菌去糖基化在体内激活的前体药物^[17,18]。Wang等人^[19]于2011年分别同时给几名健康志愿者食用适量人参根粉末，分别在不同的时间段对志愿者的血浆进行检测，结果发现人参皂苷出现的顺序为Rb1、Rd、Rg2 和 CK。与此同时人参皂苷CK含量增加的同时人参皂苷Rb的含量也在相应的减少。这个试验进一步证实了肠道微生物菌群可以有效地将人参皂苷Rb1加工成具有高度生物活性的化合物CK，然后通过体循环输注。这一发现引起了研究人员对人参皂苷CK的高度关注，进一步对其生物学和药理学活性做大量的研究。

2 生物转化合成法

由于人参皂苷CK有显著的药理学活性特征，可以由人或大鼠的肠道微生物群从其它108种原人参二醇(PPD)型人参皂苷产生，研究主要集中在将常量人参皂苷转化为稀有人参皂苷，通常采用化学或物理转化的方法，例如加热法和酸碱水解法。除此之外，人参皂苷CK的转化还可以采用生物转化合成法，比如酶转化、微生物转化以及化学结构修饰等模式。大多数人参皂苷属于次要人参皂苷，如Rh1、Rh2、Rg3、F2和化合物K等，主要都是由常量人参皂苷所制备^[46]产生的，人参皂苷CK是一种通过生物转化合成从PPD型人参皂苷生成的非天然人参皂苷^[47]。之前所说通过物理和化学转化方法将主要的人参皂苷转化为稀有的人参皂苷^[48]，但由于这两种转化方法会引起副作用，特别是化学方法转化合成的稀有人参皂苷会发生不需要的差向异构化和羟基化^[49]等副反应。这些方法都不是生物转化合成人参皂苷CK的绿色技术和环境友好型技术，可能还会造成环境污染，另一方面，通过酶转化和微生物转化合成人参皂苷CK具有选择性好、反应条件温和、环境友好等多方面优点^[50]，表现出环境兼容性。

2.1酶转化合成人参皂苷CK

酶促转化合成人参皂苷CK具有高度区域特异性的特点，是被发现获取人参皂苷CK的一种有前景的方法^[51]，它是由人参根提取物通过使用果胶酶、乳糖酶和β-糖苷酶等各种类型的酶转化合成的^[52]。一些特殊的β-葡萄糖苷酶可以特异性水解人参皂苷-β-葡萄糖苷键^[53],从而修饰人参皂苷的达玛烷型骨架结构。到目前为止，已经报道发现了许多β-葡萄糖苷酶^[54]具有将人参皂苷转化为人参皂苷CK的特异能力。Park等人从人肠道粪便中纯化和鉴定β-葡萄糖苷酶梭杆菌K-60^[55]，发现其可以特异性地将人参皂苷Rb1水解为CK，但缺点是Rb1向CK的生物转化能力较弱，合成效率较低。为了提高人参皂苷CK的转化率并扩大生产规模，Qin等人从贝氏拟青霉中纯化了一种新的人参皂苷水解β-葡萄糖苷酶。使用色谱法^[56]分析，发现人参皂苷Rb1与酶在45°C和pH 3.5的条件下反应达到最大酶活性，反应一天后，大约84.3%的人参皂苷Rb1通过Rb1→Rd→F2→CK的途径转化为CK。除以上酶外，还有重组β-葡萄糖苷酶，例如人参皂苷元Terrabacter ^[57]，大肠杆菌^[58]和黑曲霉也有将Rb1转化为CK的研究报道。

β-糖苷酶常用于人参皂苷的水解^[59]，是β-葡萄糖苷酶的替代酶，可以特异性水解PPD型人参皂苷^[60]。Noh等人用硫叶藻中产生的β-糖苷酶从人参根提取物制备CK^[61]，发现了(1) Rb1或Rb2 → Rd → F2 →化合物K和(2) Rc →化合物Mc →化合物K这两种转化途径。该方法具有良好的特异性，但其人参皂苷CK转化效率较低。因此来源于芳香微杆菌^[62]和火球菌^[63]的重组β-糖苷酶已被广泛应用于人参皂苷转化为稀有人参皂苷。重组furriocus pyloroccus furrious)高产率地将Rd转化为CK，产率为83% ^[64]。除了以上的纯酶之外，还筛选了一些粗酶来检测人参提取物的水解活性^[65]，其中α-淀粉酶、β-淀粉酶、乳化剂和橙皮苷酶表现出弱水解特性^[66,67,68];而纤维素酶、柚皮苷酶和果胶酶表现出合理的水解性质^[67]。绿色木霉纤维素酶具有较高的水解活性，可大量从PPD人参皂苷中产生人参皂苷CK。该方法简单易行，不需要有机溶剂，在人参皂苷CK的制备过程中占据显著的优势。

2.2微生物转化合成人参皂苷CK

一般来说，通过微生物转化和工程菌发酵被认为是合成人参皂苷CK的主要方法^[67]，可以使用来自副乳杆菌的粗酶^[69]，甘蔗镰刀菌^[70]，严格顶孢和雷氏茎杆菌^[66]。长谷川等人系统研究了肠道菌群对人参皂苷Rb1、Rb2和Rc的CK代谢转化^[71]，发现人参皂苷Rb1、Rb2和Rc与人肠道菌群厌氧培养后，人参皂苷被转化为CK。其中从人类肠道粪便中分离出来的细菌菌株，如拟杆菌属、双歧杆菌和真菌，这些菌可以有效地将Rc转化为CK病毒^[72]，人参皂苷Rb1在CK降解的肠道细菌代谢主要依赖于肠道微生物群组成。真菌更容易培养，与细菌的功能相似，可替代人肠道细菌通过生物转化获得CK^[70]，Zho等利用真菌生物转化从三七总皂苷(PNS)中经济有效地制备了CK^[73]。此外，由土壤栽培的人参产生的真菌也可以将常量人参皂苷良好的转化为稀有人参皂苷CK，但是这些真菌未被批准作为标准食品级微生物。因此，研究人员重点开发了食品级食用微生物—宇佐美曲霉、双歧杆菌和黑曲霉，它们可以通过Rd → F2 →化合物K ^[74]。从朝鲜主食泡菜中提取的各种菌株，如各种明串珠菌菌株，显示出PPD型人参皂苷向CK的良好转化。

除了上述方法外，开发一种基于微生物发酵的替代CK生产方法将是一个有希望的解决方案，因为许多活性天然产物，包括青蒿素酸、阿片样物质和托品烷生物碱，都是通过微生物发酵获得的^[75–77]。2014年，我们发现了一种UDP糖基转移酶UGTPg1，它分解PPD的区域特异性糖基化，产生CK。这一发现导致了CK生物合成途径的完全阐明，并为使用合成生物学方法生产CK铺平了道路。通过将PPD产生途径以及UGTPg1引入酿酒酵母，首次实现了从简单碳源进行从头CK生产。然而，该原理验证菌株产生的效价非常低^[78]，不适合工业化。2019年，李等人在解脂耶氏酵母中重构了生物合成途径，实现了的从头生产，在关键MVA途径基因过度表达以及细胞色素P450 PgPPDS与NADPH-P450还原酶ATR1融合后，通过补料分批发酵，CK效价达到161.8mg/L^[79]。最近，Dong等人通过将生物合成2，3-氧化喹烯的基因的过表达、多拷贝密码子优化的PgDDS和PgPPDS基因的整合，以及UGT基因的引入和优化，实现了CK通过补料分批发酵测得的效价为1.17g/L^[80]。迄今为止，工程微生物中CK效价最高的生产是通过结合途径优化和补料分批发酵中添加乙醇和甘油实现的，达到1.7 g/L ^[81]。尽管取得了这些成就，但目前基于微生物发酵的CK滴度仍被限制在< 2g/L；因此，通过酵母发酵进行CK生产在经济上尚不可行。开发一种高效价微生物，基于发酵的人参皂苷CK生产平台，首先通过引入关键的UGT在酵母中完成了完全CK途径将biopart、UGTPg1整合到先前构建的PPD生产机箱中。接下来，我们通过调整UGTPg1基因，并增加CK滴度超过4倍。通过增加UDP-葡萄糖生物合成和抑制UDP-葡萄糖消耗来促进UDP-葡萄糖供应，我们获得了一系列具有增加的CK产量的酵母菌株。最后采用平行生物反应器系统补料分批发酵，CK效价达到5.74 g/L，这为工程菌发酵合成人参皂苷CK提供了潜在的工业应用，从而低成本和高效率制造。